摘要：目的探讨去氢吴茱萸碱对实验性胃溃疡大鼠胃黏膜的保护作用及机制，为临床应用提供数据。方法选取雄性健康SD大鼠，采用乙酸烧灼法建立胃溃疡模型。将40只模型大鼠随机分为模型组，去氢吴茱萸碱低、高（6.25、12.5mg/kg）剂量组和阳性对照（奥美拉唑10mg/kg）组，另取10只健康大鼠设为假手术组。各组大鼠ig相应剂量药物，假手术组与模型组大鼠则给予等量生理盐水。14d后，比较各组大鼠的胃溃疡面积、胃溃疡抑制率、胃黏膜修复因子、血清氧化应激因子、血清炎症因子、胃组织相关蛋白水平。结果与模型组比较，去氢吴茱萸碱可显著降低胃黏膜溃疡面积（P＜0.05、0.01），显著升高胃溃疡抑制率；可有效促进胃组织中三叶因子1（TFF1）和胃组织表皮生长因子（EGF）水平的增加（P＜0.05、0.01）；可明显降低大鼠血清中丙二醛（MDA）、环氧酶2（COX-2）、肿瘤坏死因子（TNF-α）和白细胞介素（IL-6）水平；明显提高血清中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）活性（P＜0.05、0.01）；同时大幅下调胃组织中Rho、ROCK1、ROCK2和NF-κB的表达水平（P＜0.05、0.01）。结论去氢吴茱萸碱可通过抗氧化应激、抗炎症因子对大鼠胃溃疡产生明显改善作用，其潜在作用机制可能与调控Rho/NF-κB信号通路有关。
消化性溃疡是临床常见的发生在胃与十二指肠的溃疡，其门诊新症发病率约占0.19%，1年内复发率约为1.5%[1]。胃溃疡是临床常见、发病率较高、难治愈性的消化性溃疡，其发病机制主要为胃黏膜表面的“损伤因子”和“保护因子”之间的失衡，胃消化液将胃黏膜消化从而导致黏膜基层组织损伤[2]。应激状态、物理和化学刺激的条件下均可诱发胃溃疡，而胃酸分泌异常是引起溃疡的主要原因[3]。临床胃溃疡患者常采用H2受体阻滞剂和质子泵抑制剂等药物进行干预，但因其不良反应、复发率高等问题使得胃溃疡的治疗策略受到限制。因此寻找新的胃溃疡治疗药物具有重大意义。
胃溃疡属中医“胃脘痛”“胃痞满”范畴，常因情绪失畅、脾胃虚弱或饮食不节等原因造成，引起脾胃受伤、食物滞留而产生反酸、恶心与嗳气等症状，久而久之则可致胃痛和呕吐[4]。中医常用辩证疗法，使其到达活血化瘀、脾升胃降、通则不痛的功效[5]。吴茱萸属芸香科植物吴茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.，石虎E.rutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalis(Dode)Huang或疏毛吴茱萸E.rutaecarpa(Juss.)Benth.var.bodinieri(Dode)Huang的干燥近成熟果实，始载于《神农本草经》。其性热，味辛、苦，具有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻等功效，临床用于寒凝疼痛、胃寒呕吐或虚寒泄泻等疾病的治疗[6-7]。从20世纪60年代起，国内外学者从吴茱萸中分离出各类生物碱、柠檬苦素、黄酮和酚酸等。而药理学研究发现吴茱萸具有良好的镇痛、抗菌、止呕、止泻和抗肿瘤作用，且其在抗胃溃疡方面疗效明确[8-10]。目前，去氢吴茱萸碱的研究主要集中在大脑功能保护方面[11-12]，然而其是否参与了吴茱萸的抗胃溃疡活性尚不明确。因此，本课题组拟建立胃溃疡大鼠模型，深入挖掘去氢吴茱萸在胃溃疡治疗方面的作用及机制，为胃溃疡的治疗提供新的策略，也为吴茱萸的临床应用夯实科学依据。
1材料
1.1动物
清洁级健康雄性SD大鼠（～g），8周龄。北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK（京）-。大鼠饲养于层流架中，每组10只，自由进食饮水，（23±2）℃，湿度45%～65%，12h/12h昼夜交替。
1.2实验试剂及仪器
去氢吴茱萸碱（质量分数≥98%，产品批号FY-B，南通飞宇生物科技有限公司）；奥美拉唑胶囊（产品批号，哈药集团三精制药诺捷有限责任公司）；丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、环氧化酶-2（COX-2），均购自南京建成生物工程研究所；三叶因子1（TFF1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和表皮细胞生长因子（EGF），美国Sigma-Aldrich公司；细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒（P）购自上海碧云天生物技术有限公司；Ras同源蛋白（Rho）、Rho相关激酶1（ROCK1）、Rho相关激酶2（ROCK2）和核转录因子（NF-κB），均购自美国Abcam公司；彩色预染蛋白质marker、蛋白上样缓冲液、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、PVDF膜等均购自武汉博士德生物工程有限公司；电泳仪、电泳槽均购自美国E-CApparatus公司；Westernblotting转膜系统、GelDoc凝胶成像仪均购自美国Bio-Rad公司；ELx酶标仪购自美国Biotek公司；3K15离心机购自德国Sigma公司。
2方法
2.1模型建立、分组和给药
将SD大鼠适应性喂养5d后禁食不禁水24h，ip3%戊巴比妥钠0.01mL/g体质量进行麻醉。0.5%碘伏对大鼠腹部皮肤消毒，随后沿左肋下缘开腹，将胃轻轻拉出。于胃窦前壁小弯侧肌层和浆膜层之间注射50μL冰乙酸，直至出现白色不透明隆，逐层缝合腹壁[13]。另取10只进行手术但未注射冰乙酸的大鼠作为假手术组。继续饲养5d，取40只造模成功大鼠（食欲下降、活动减少、四肢无力）分为模型组，去氢吴茱萸碱低、高（6.25、12.5mg/kg）剂量组和阳性对照（奥美拉唑10mg/kg）组。各给药组大鼠ig相应剂量药物，模型组和假手术组ig等量生理盐水。各组大鼠每日给药1次，连续2周。
2.2去氢吴茱萸碱对实验性胃溃疡大鼠胃溃疡的影响
待大鼠处死后取出胃体，将各组大鼠的胃分为2份，并分别进行如下操作：取1份胃剖开，采用游标卡尺对溃疡长度（d1）和宽度（d2）进行测量，设溃疡最大直径为d1，以其垂直的最宽长度为d2，并计算胃溃疡面积（S）和胃溃疡抑制率[14]。随后将胃进行固定，经过常规脱水、透明、浸蜡与包埋等步骤，切成4μm薄片，对其进行HE染色，中性树胶封片，置于显微镜下进行观察、拍摄。同时，用生理盐水清洗另1份胃，?80℃存放，用于后续胃组织蛋白检测。
S＝π·d1/2·d2/2
胃溃疡抑制率＝（S模型－S给药）/S模型
2.3去氢吴茱萸碱对实验性胃溃疡大鼠胃黏膜修复因子的影响
对大鼠采用腹部主动脉取血，静置30min后低温离心（r/min）5min，分离上层血清并与?20℃保存。根据试剂盒说明书检测血清中TFF1和EGF水平。
2.4去氢吴茱萸碱对实验性胃溃疡大鼠血清生化指标的影响
对大鼠采用腹部主动脉取血，静置30min后低温离心（r/min）5min，分离上层血清并与?20℃保存。根据试剂盒说明书检测血清中氧化应激因子MDA、GSH-Px、SOD和炎症因子COX-2、TNF-α、IL-6水平。
2.5去氢吴茱萸碱对实验性胃溃疡大鼠胃组织相关蛋白水平的影响
取胃组织溶于裂解缓冲液中，根据BCA试剂盒说明书对蛋白浓度进行测定。经上样缓冲液孵育后，各组取等量蛋白使用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，随后转移到聚偏二氟乙烯膜。经5%BSA封闭后入Rho、ROCK1、ROCK2和NF-κB一抗（1∶0）在?4℃冰箱孵育过夜。次日在常温条件下滴加二抗（1∶0）孵育30min，化学发光蛋白检测试剂盒显影成像。使用ImageJ软件对蛋白表达进行半定量，β-Tubulin作为内参。
2.6统计学处理
采用SPSS16.0软件包进行数据统计。计量资料数据以表示，组间比较采用One-wayANOVA方差分析。
3结果
3.1去氢吴茱萸碱对实验性胃溃疡大鼠胃溃疡的影响
与模型组比较，去氢吴茱萸碱低、高剂量组和奥美拉唑组大鼠胃黏膜溃疡面积明显缩小（P＜0.05、0.01），且去氢吴茱萸碱高剂量组和奥美拉唑组的改善作用最为明显（P＜0.01）。且去氢吴茱萸碱高剂量组和奥美拉唑组的胃溃疡抑制率分别为（52.88±6.43）%、（57.02±4.33）%，略高于去氢吴茱萸碱低剂量组，见表1。HE染色显示模型组大鼠的胃黏膜受损严重，坏死性病变深入黏膜，黏膜下层广泛水肿，白细胞浸润进入黏膜下层。不同质量浓度的去氢吴茱萸碱处理后，胃黏膜总溃疡面积、水肿及白细胞浸润减少。同样奥美拉唑治疗的大鼠，存在表面上皮黏膜的轻度破坏，但不存在深层黏膜损伤。见图1。
3.2去氢吴茱萸碱对实验性胃溃疡大鼠胃黏膜修复因子的影响
与假手术组比较，模型组大鼠血清TFF1和EGF水平略有增加，但差异并不明显。与模型组比较，去氢吴茱萸碱低、高剂量组和奥美拉唑组大鼠TFF1和EGF水平均明显增加（P＜0.05、0.01）。在TFF1表达方面，去氢吴茱萸碱高剂量组和奥美拉唑组的上调作用较强（P＜0.01）；而在EGF表达方面，去氢吴茱萸碱低、高剂量组和奥美拉唑组的作用均较为显著，组件比较差异具有统计学意义（P＜0.01）。见表2。
3.3去氢吴茱萸碱对实验性胃溃疡大鼠血清氧化应激因子的影响
与假手术组比较，模型组大鼠血清MDA水平显著提升（P＜0.01），GSH-Px和SOD水平显著下降（P＜0.01）。与模型组比较，去氢吴茱萸碱低、高剂量组和奥美拉唑组大鼠MDA水平明显下降（P＜0.05、0.01），GSH-Px和SOD水平明显升高（P＜0.05、0.01）。见表3。
3.4去氢吴茱萸碱对实验性胃溃疡大鼠血清炎症因子的影响
与假手术组比较，模型组大鼠血清COX-2、TNF-α和IL-6水平显著增加，两组比较差异具有统计学意义（P＜0.01）。与模型组比较，去氢吴茱萸碱低、高剂量组和奥美拉唑组大鼠COX-2、TNF-α和IL-6水平明显下降，两组比较差异具有统计学意义（P＜0.05、0.01）。见表4。
3.5去氢吴茱萸碱对实验性胃溃疡大鼠胃组织相关蛋白水平的影响
与假手术组比较，模型组大鼠胃组织中Rho、ROCK1、ROCK2及NF-κB的表达水平显著上调（P＜0.01）。经给药后各组大鼠胃组织中Rho、ROCK1、ROCK2及NF-κB的表达水平降低，与模型组比较差异明显（P＜0.05、0.01）。在调控Rho、ROCK1和NF-κB表达方面，以去氢吴茱萸碱高剂量和奥美拉唑的下调作用较为强烈（P＜0.01）；而在调控ROCK2表达方面，去氢吴茱萸碱高、低剂量和奥美拉唑组的作用均较为显著（P＜0.01）。见图2。
4讨论
消化性溃疡通常认为是发生在胃与十二指肠的慢性溃疡，是一种胃肠相关的多发病、常见病，其主要表征为血液流动减少、嗜中性粒细胞浸润，氧化应激和炎性细胞因子的分泌激增等[15-16]。目前临床胃溃疡治疗常用抗酸药、质子泵抑制剂、H2受体阻断剂和抗菌药等，但一系列不良反应日趋严重。因此寻求一种对生理性胃酸分泌和机体菌群影响较小且安全高效的药物迫在眉睫。研究显示天然植物化学提取物具有非营养性的的生物学作用，如抗氧化、抗衰老和抗菌等，这些天然产物可提高机体抵抗力，改善心脑血管和消化系统损伤，甚至可下调肿瘤的发生[17]，因此有望从天然产物中挖掘出高效、安全的抗胃溃疡药物。在临床前胃溃疡实验研究中通常采用乙酸型大鼠模型，该模型与临床特点类似如形态、修复过程接近、持续时间久等[18]，适用于药物抗胃溃疡的药效评价和药理机制研究。因此，本课题采用乙酸造模法建立胃溃疡大鼠模型，继而开展关于去氢吴茱萸碱治疗胃溃疡的药效评价及机制研究。
氧化应激可产生大量自由基与活性氧簇，加剧组织脏器损伤，是机体应对外界伤害性刺激的一种应激反馈。研究表明胃黏膜在损伤刺激（如强酸、酒精等）下可产生氧化应激反应，导致抗氧化因子（SOD、GSH-Px）与氧化因子（MDA）失衡，继而损伤胃黏膜，形成胃溃疡、病情绵延难愈[19]。实验结果显示去氢吴茱萸碱可有效增加体内SOD、GSH-Px水平，降低MDA水平，继而调节机体氧化/抗氧化平衡。在溃疡组织中，炎症因子如TNF-α、IL-1大量释放可激活促炎级联反应，诱导COX-2生成，继而加剧胃黏膜损伤、抑制溃疡修复。而通过下调COX-2表达可抑制胃酸分泌、促进溃疡愈合[20]。研究结果表明去氢吴茱萸碱可有效抵抗炎症因子TNF-α、IL-1和COX-2释放异常而造成的胃黏膜损伤。同时，EGF作为内源性化合物，在维持胃黏膜完整方面发挥重要作用，可保持胃黏膜完整性、促进胃黏膜自愈，有效缩小溃疡面积并增加血流量[21-22]。TFF1属胃肠道黏液细胞分泌的小分子多肽，主要由胃黏膜上皮细胞表达，具有物理屏障功能，可有效抵抗外界刺激对胃黏膜的破坏[23]。本研究发现，去氢吴茱萸碱能明显增加胃组织中EGF和TFF1的表达量。由此提示，去氢吴茱萸碱可通过调节机体抗氧化/氧化平衡、改善体内炎症反应，促进胃黏膜修复，最终对胃黏膜溃疡产生保护作用。Rho家族是一类小G蛋白，参与多种细胞信号传导。Rho激酶（ROCK）作为Rho信号通路的效应分子，主要包括ROCK1和ROCK2两种亚型，它们在调控单核/巨噬细胞趋化、黏附、增生和炎症反应等方面发挥重要作用[24]。Rho/ROCK还可激活NF-кB信号通路，而NF-κB分布在各种细胞，参与氧化应激和炎症反应的调节，继而有效促炎介质（TNF-α、IL-6）的分泌[25-26]。结果表明去氢吴茱萸碱可有效下调胃组织中Rho、ROCK1、ROCK2和NF-κB的表达水平。提示去氢吴茱萸碱可通过介导Rho/NF-κB信号，继而发挥抗胃溃疡中炎症反应及氧化应激的作用。
综上所述，去氢吴茱萸碱可通过抑制Rho/NF-κB信号传导，调控胃溃疡大鼠体内炎症反应，改善氧化应激，继而防止胃黏膜损伤。同时促进胃局部的TFF1和EGF的释放，加速胃黏膜修复。因此去氢吴茱萸碱可通过抑制胃黏膜损伤、促进胃黏膜修复，从而发挥治疗胃黏膜溃疡的作用。
参考文献（略）
来源：万军，包奇昌．去氢吴茱萸碱对实验性胃溃疡大鼠胃黏膜的保护作用及机制研究[J].中草药,,51(18):-.
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